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果蝇卵巢生殖干细胞（germline stem cell，简称GSC）是干细胞生物学研究的理想模型【1】，其增殖与分化受细胞内在调控因子和微环境信号共同作用。许多参与调控GSC的内源基因与哺乳动物干细胞发育相关基因，在功能上具有很高的同源性。野生型果蝇卵巢是由32-40个卵巢小管构成，每个卵巢小管的生殖腺前端仅有2-3个GSC。由于野生型果蝇卵巢GSC数量稀少，在单细胞水平分离、纯化GSC，构建生殖细胞图谱和研究GSC细胞特异转录特征变得困难重重。

2023年8月21日，华南农业大学植物保护学院钟国华教授团队在EMBO Reports上发表了题为Single-cell RNA sequencing identifies eggplant as a regulator of germ cell development in Drosophila的研究成果。

研究人员首先利用单细胞转录组测序（scRNA-seq）对野生型果蝇卵巢进行研究，分析得到24个不同细胞亚群的单细胞转录组图谱。结合marker基因表达模式和拟时序分析，进一步对生殖细胞群进行合并和筛选，最终获得6类生殖细胞亚群：GSC、未分化生殖细胞群-1、未分化生殖细胞群-2、早期滋养细胞，卵细胞和末期滋养细胞。利用生信分析（SCENIC分析、GO/KEGG富集分析）和RNAi筛选，构建GSC维持和分化的潜在基因调控网络。随后，作者利用原位杂交和免疫组化实验，鉴定出9个新GSC特异表达marker基因和1个合胞体（cyst）标记基因。研究发现，在转录和蛋白水平上，eggplant（eggpl）特异表达于早期未分化生殖细胞（GSC/CB）中, 并且主要在GSC中高表达。有趣的是，eggpl在幼虫和成虫阶段的雌/雄虫生殖腺前端也高表达。功能上，eggplRNAi或纯合突变引起的基因表达下调，会显著增加2-cell，4-cell，8-cell cysts数量并加速这些细胞的细胞周期。eggpl表达下调能够显著促进卵子形成，导致卵巢体积增大。这些结果表明，eggpl对调控早期生殖细胞分化具有重要意义。富含酵母的培养条件下，果蝇卵巢eggpl表达量显著降低，cysts细胞的细胞周期速率显著增加，卵巢体积也显著增加（图1）。因此，推测eggpl可能是一种参与营养信号转导的生殖细胞内在信号分子。

（图1）不同营养条件对eggpl表达量，cysts细胞周期和卵巢发育的影响

为了验证eggpl是否参与Insulin信号通路调节GSC增殖分化，研究人员利用Gal4/UAS系统特异驱动Dp110CA或Dp110DN进而调节PI3K（一种Insulin信号正调节因子）在生殖细胞的活性。研究发现，过表达Dp110CA能够显著增加BrdU+cysts细胞数，此结果与在富含酵母的培养条件下，果蝇卵巢cysts细胞表型一致。然而，过表达Dp110DN能够显著减少BrdU+cysts细胞数。有趣的是，eggpl下调表达能够抑制过表达Dp110DN引起的BrdU+cysts减少。这些结果表明，eggpl可能是PI3K的下游调控因子。与此同时，研究还发现，不论在富含酵母的培养条件下或标准培养条件下，过表达Dp110DN均能显著增加Eggpl的蛋白表达量，而过表达Dp110CA均能显著减少Eggpl的蛋白表达量。综上所述，eggpl作为Insulin信号通路的下游调控因子参与调控GSC增殖分化过程（图2）。

（图2）PI3K调节eggpl表达验证及eggpl调控GSC分化模式图

本研究的意义：1.揭示了果蝇卵巢早期生殖细胞系在单细胞转录水平的分化发育特点，分析获得的GSC单细胞转录组数据为生殖细胞生物学研究提供重要参考资源；2.首次报道eggpl的表达模式和eggpl突变卵巢表型特征，创新性提出eggpl可能作为Insulin通路下游靶标因子参与调节GSC分化的新模式。

本论文工作主要由华南农业大学植物保护学院博士研究生孙智鹏（论文第一作者）完成，加州大学旧金山分校医学院Todd. Nystul教授和华南农业大学植物保护学院钟国华教授为论文共同通讯作者。

原文链接：https://doi.org/10.15252/embr.202256475

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